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400-6111-883
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400-6111-883
Supfluor 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells Supfluor 488 Caspase-3活细胞分析试剂盒
产品货号:40273ES25
产品规格:25 T
产品价格:¥783.00
类别:细胞凋亡与吞噬

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    储存

    价格

    Supfluor 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells

    Supfluor 488 Caspase-3活细胞分析试剂盒

    40273ES25

    25 T

    4℃避光保存

    783.00

    40273ES60

    100 T

    4℃避光保存

    2583.00


    产品描述

    活细胞分析试剂盒包含Supfluor 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制剂。Supfluor 488 Caspase-3 Substrate为基于Caspase-3/7活力检测细胞凋亡提供了有效的工具,适用于荧光显微观察和流式细胞仪分析。

    相较于其它基于(FLICA)分析的 Caspase 的荧光底物或荧光抑制,试剂盒内提供的Substrate 检测Caspase-3/7 活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate 最初无荧光,其会穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中Caspase-3/7剪切Substrate释放高亲和性的DNA 染料,这种染料迁移到细胞核标记DNA 并发出明亮的绿色荧光。Substrate 是双功能的,既可以检测 Caspase-3/7 活性,又能可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。Supfluor 488 染色可以进行甲醛固定并兼容后续免疫染色实验。

    光谱特性Supfluor 488:  Ex/Em=500/530nm(with DNA)


    产品组分

    编号

    组分名称

    产品编号/规格

    40273ES25(25T)

    40273ES60(100T)

    40273-A

    Supfluor 488 Caspase-3 Substrate, 0.2 mM in DMSO

    125 µL

    500 µL

    40273-B

    Caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO, 2 mM in DMSO

    20 µL

    100 µL


    运输与保存方法

    冰袋(wet ice)运输。储存于4ºC,至少可以储存6个月。


    注意事项

    1、细胞可用Hoechst 33342 染料(推荐浓度1 μM)共染,使细胞核产生蓝色荧光染色(Ex/Em=346/460 nm)。

    2、Supfluor 488 染料可用甲醛固定,但与甲醇固定不兼容。

    3、经甲醛固定的Supfluor 488染色细胞可用0.1% TritonX-100 处理后进行后续染色,但这样处理后的染色亮度可能会减弱。

    4、操作时请采取防护措施,穿防护服、戴一次性手套等。


    使用方法
    1. 实验优化

    下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。Supfluor 488 Substrate 可进行细胞长时间孵育过程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。推荐底物浓度1-10 μM之间。细胞可在培养基、PBS或其他的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞,建议更换新鲜含有底物的培养基,以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞的操作是自由选择的。

    2. 对照设定

    推荐设定以下对照:

    A. 阴性对照:不诱导凋亡的细胞

    B. 阳性对照:诱导凋亡的细胞

    C. 抑制剂对照:诱导细胞凋亡同时(或提前10-30 min)孵育Caspase-3/7抑制剂,最后再添加Supfluor 488 Caspase-3底物。

    3.  抑制剂对照

    试剂盒中所提供的Caspase-3/7 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 可用来确认Caspase-3/7 依赖于Supfluor 488 的荧光信号。对于抑制剂对照,抑制剂的终浓度应至少是底物浓度的2倍(例如当使用5 μM Supfluor 488 底物时,Ac-DEVD-CHO浓度为 10 μM)。添加底物前在室温下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min,加入底物后,孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO 是可逆的竞争性抑制剂。对于某些细胞类型有效的Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂,如Z-DEVD-FMK,或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。

    4. 流式细胞仪分析

    4.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。

    4.2 对于贴壁细胞,实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。

    4.3 用细胞培养基或合适缓冲液重悬细胞,使细胞密度达到106个/mL数量级

    4.4 添加200 μL 细胞悬液至流式细胞试管。

    4.5 抑制剂对照样本,用Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

    4.6 200 μL细胞悬液中加5 μL 0.2 mM 的Substrate并立即混匀使底物浓度为5 μM。不同类型细胞最佳底物浓度可能不同,需进一步优化。

    4.7 室温避光孵育15-30 min。

    4.8 加入300 μL细胞培养基或PBS,使用流式细胞仪分析,选择检测绿色荧光的通道(激发/发射:485/515 nm)。

    5. 荧光显微镜观察

    5.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。

    5.2 抑制剂对照样本,用Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

    5.3 用含5 μM Substrate 的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液(见试验优化)。对于抑制剂对照组,抑制剂与底物一同孵育。

    5.4 室温孵育30 min 或更长时间。

    5.5 PBS或其它缓存液清洗细胞,荧光显微镜观察细胞,使用观察绿色荧光的滤片(激发/发射:485/515 nm)。

    6. 荧光酶标仪检测

    6.1 将贴壁细胞生长在黑色96孔板中;对于悬浮细胞调整密至106个/mL,0.2 mL细胞悬液分装到一孔。

    6.2 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。(注意:细胞可能在管或瓶中处理,然后转移到 96孔检测板。)

    6.3 抑制剂对照样本,用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

    6.4 对于悬浮细胞,直接添加Substrate 混匀。对于贴壁细胞,用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液(见试验优化)。对于抑制剂对照组,抑制剂与底物一同孵育。

    6.5 细胞可以在含有Substrate 的培养基中直接观察。

    6.6 对于悬浮细胞,轻轻震荡重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部阅读方式建议贴壁细胞。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。

    HB190428